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a cura di Giovanni Maga,LIBRO MULTIMEDIALE, Prefazione 1 3 1 2 Preparazione di un estratto cellulare 30. 3 1 3 Purificazione del DNA da un estratto,cellulare 31. Parte I Rimozione dei contaminanti tramite estrazione con. solventi organici e digestione enzimatica 31, I principi fondamentali del clonaggio Utilizzo della cromatografia a scambio ionico per la. dei geni e dell analisi del DNA 3 purificazione del DNA da estratti cellulari 32. Utilizzo del silice per purificare il DNA da estratti. cellulari 32,Capitolo 1 3 1 4 Concentrare il DNA 35. 3 1 5 Misurare la concentrazione di DNA 35,L importanza del clonaggio dei geni.
3 1 6 Altri metodi di isolamento del DNA cellulare. e dell analisi del DNA 5, 1 1 I primi sviluppi della genetica 5 3 2 Isolamento del DNA plasmidico 37. 1 2 L introduzione del clonaggio e della 3 2 1 Separazione sulla base delle dimensioni 38. reazione a catena della polimerasi PCR 6 3 2 2 Separazione in base alla conformazione 39. 1 3 Cosa si intende per clonaggio di un gene 6 La denaturazione alcalina 39. 1 4 Cos la PCR 8 La centrifugazione in gradiente di densit con. bromuro d etidio e cesio cloruro 40, 1 5 Perch il clonaggio genico e la PCR sono 3 2 3 Amplificazione dei plasmidi 42. importanti 9,3 3 Isolamento del DNA fagico 42,1 5 1 Ottenere una preparazione pura di un gene. attraverso il clonaggio 9 3 3 1 Allestimento di colture per ottenere titoli. elevati di fago 43,1 5 2 Anche la PCR pu essere usata per isolare un. gene 11 3 3 2 Preparazione di fagi non lisogeni 44. 1 6 Come orientarsi in questo libro 13,3 3 3 Raccolta dei fagi da una coltura di cellule.
infette 44,Bibliografia 14,3 3 4 Purificazione del DNA dalle particelle di. Capitolo 2 3 3 5 La purificazione del DNA di M13 meno. I vettori per il clonaggio dei geni problematica 46. plasmidi e batteriofagi 15 Bibliografia 47,2 1 Plasmidi 15. 2 1 1 Dimensione e numero di copie 17 Capitolo 4, 2 1 2 Coniugazione e compatibilit 18 La manipolazione del DNA purificato 48. 2 1 3 Classificazione dei plasmidi 18, 2 1 4 Plasmidi in organismi diversi dai batteri 19 4 1 Gli enzimi per la manipolazione del DNA 49. 4 1 1 Le nucleasi 49,2 2 Batteriofagi 19,4 1 2 Le ligasi 51.
2 2 1 Il ciclo infettivo dei fagi 20,4 1 3 Le polimerasi 51. 2 2 2 Fagi lisogeni 21, I geni sul DNA del fago sono organizzati in gruppi 22 4 1 4 Gli enzimi che modificano il DNA 53. Il DNA del fago pu essere lineare o circolare 23 4 2 Gli enzimi che tagliano il DNA le. M13 un fago filamentoso 24 endonucleasi di restrizione 53. 2 2 3 Virus come vettori di clonaggio per altri 4 2 1 La scoperta e la funzione delle endonucleasi. organismi 26 di restrizione 54, Bibliografia 26 4 2 2 Le endonucleasi di restrizione di tipo II. tagliano il DNA in corrispondenza di,sequenze nucleotidiche specifiche 55. Capitolo 3 4 2 3 Estremit piatte ed estremit coesive 56. La purificazione del DNA dalle cellule 27 4 2 4 Determinazione della frequenza delle. 3 1 Isolamento del DNA cellulare totale 27 sequenze bersaglio in una molecola di DNA 57. 3 1 1 Crescita e raccolta di una coltura di cellule 4 2 5 Eseguire una digestione con enzimi di. batteriche 28 restrizione in laboratorio 58, 4 2 6 Analisi dei risultati della reazione di taglio 5 5 1 Trasformazione di singole cellule 89.
da parte di un endonucleasi di restrizione 60 5 5 2 Trasformazione di interi organismi 91. Separazione delle molecole tramite elettroforesi su. gel 60 Bibliografia 91, Visualizzazione delle molecole di DNA all interno del. gel di agarosio 60 Capitolo 6,4 2 7 Determinazione delle dimensioni delle. molecole di DNA 62,I vettori di clonaggio per Escherichia. 4 2 8 Mappatura della posizione dei siti di coli 92. restrizione lungo la molecola di DNA 62 6 1 Vettori derivati da plasmidi di E coli 92. 4 2 9 Tecniche specializzate di elettroforesi su gel 6 1 1 Nomenclatura dei vettori di clonaggio. per la separazione di grandi molecole di DNA 65,plasmidici 93. 4 3 La ligazione unire insieme frammenti 6 1 2 pBR322 possiede propriet utili 93. di DNA 67 6 1 3 Il pedigree di pBR322 94,4 3 1 Il meccanismo d azione della DNA ligasi 67.
6 1 4 Vettori plasmidici avanzati per E coli 94, 4 3 2 Le estremit coesive aumentano l efficienza pUC8 vettore con selezione per il fenotipo Lac 95. della ligazione 67 pGEM3Z vettore per la trascrizione in vitro del DNA. 4 3 3 Come dotare di estremit coesive una clonato 97. molecola di DNA con estremit piatte 68,6 2 Vettori derivati dal fago 98. 6 2 1 Segmenti del genoma di possono essere,Adattatori 69. deleti senza compromettere la funzionalit,Code omopolimeriche 72. del fago 98,4 3 4 Ligazione di estremit piatte con la DNA.
6 2 2 Isolamento di fagi modificati privi di specifici. topoisomerasi 73,siti di restrizione tramite selezione naturale 99. Bibliografia 75 6 2 3 Vettori di inserzione e di sostituzione 100. Vettori di inserzione 101,Capitolo 5 Vettori di sostituzione 101. L introduzione di DNA nelle cellule 6 2 4 Il clonaggio con vettori di inserzione e di. sostituzione 102,viventi 76,6 2 5 Lunghi frammenti di DNA possono essere. 5 1 La trasformazione la captazione del clonati nei cosmidi 103. DNA da parte delle cellule batteriche 78 6 2 6 I vettori e altri vettori a elevata capacit. 5 1 1 Le specie batteriche hanno efficienze permettono la costruzione di librerie genomiche 104. differenti nell incorporare DNA esogeno 78 6 3 Vettori per la produzione di DNA a. 5 1 2 Preparazione di cellule competenti di E coli 78 singola elica 105. 5 1 3 Selezione delle cellule trasformate 79 6 3 1 Vettori basati sul batteriofago M13 105. 5 2 L identificazione dei ricombinanti 81 6 3 2 Vettori ibridi plasmide M13 106. 5 2 1 La selezione dei ricombinanti per pBR322 6 4 Vettori per altri batteri 108. avviene tramite inattivazione inserzionale di, un gene di resistenza agli antibiotici 81 Bibliografia 109. 5 2 2 L inattivazione inserzionale non sempre, riguarda la resistenza a un antibiotico 83 Capitolo 7.
5 3 L introduzione di DNA fagico nelle I vettori di clonaggio per le cellule. cellule batteriche 85,eucariotiche 110,5 3 1 La trasfezione 85. 5 3 2 L impacchettamento in vitro di vettori di 7 1 Vettori per lieviti e altri funghi 110. clonaggio basati sul fago 85 7 1 1 Marcatori di selezione per il plasmide 2 m 111. 5 3 3 L infezione da parte dei fagi causa la 7 1 2 Vettori derivati dal plasmide 2 m i plasmidi. formazione di placche in terreno agar 85 episomici di lievito 112. 5 4 L identificazione dei fagi ricombinanti 87 7 1 3 Il plasmide YEp pu integrarsi nel DNA. 5 4 1 Inattivazione inserzionale del gene lacZ cromosomico di lievito 112. portato da un vettore fagico 87 7 1 4 Altri tipi di vettori per il clonaggio in lievito 112. 5 4 2 Inattivazione inserzionale del gene c I di 87 7 1 5 I cromosomi artificiali possono essere utilizzati. 5 4 3 Selezione tramite fenotipo Spi 88 per clonare lunghi frammenti di DNA in lievito 115. 5 4 4 Selezione sulla base delle dimensioni del La struttura e l utilizzo di un vettore YAC 115. genoma di 89 Applicazioni dei vettori YAC 117, 5 5 L introduzione di DNA nelle cellule non 7 1 6 Vettori per altri lieviti e funghi 117. batteriche 89 7 2 Vettori per le piante superiori 117. 7 2 1 Agrobacterium tumefaciens il pi piccolo Le sonde eterologhe permettono l identificazione. ingegnere genetico naturale 118 di geni simili 149. Utilizzo del plasmide Ti per introdurre geni esogeni L ibridazione col metodo di Southern consente di. in una cellula vegetale 118 identificare un frammento di restrizione specifico. Produzione di piante trasformate con il plasmide Ti 121 contenente il gene desiderato 150. Il plasmide Ri 122 8 4 4 Metodi di identificazione basati sul. Limitazioni del clonaggio con i plasmidi di rilevamento della presenza del prodotto di. Agrobacterium 122 traduzione del gene clonato 151, 7 2 2 Il clonaggio di geni in piante per I metodi di rilevazione immunologica richiedono la. presenza di anticorpi 152,trasferimento genico diretto 123. Utilizzo di anticorpi purificati per la rilevazione di. Trasferimento genico diretto nel nucleo 123,una proteina in colonie ricombinanti 152.
Inserimento di geni nel genoma dei cloroplasti 125. Il problema dell espressione genica 153, 7 2 3 Tentativi di utilizzare i virus delle piante. come vettori di clonaggio 125 Bibliografia 154,Vettori basati sui caulimovirus 125. Vettori basati sui geminivirus 126 Capitolo 9, 7 3 Vettori per gli animali 127 La reazione a catena della polimerasi. 7 3 1 Vettori di clonaggio per gli insetti 127 PCR 155. Gli elementi P come vettori di clonaggio per Drosophila 127. Vettori di clonaggio basati su virus degli insetti 128 9 1 La PCR in breve 155. 7 3 2 Il clonaggio nei mammiferi 129 9 2 La PCR in maggiore dettaglio 158. Virus come vettori di clonaggio per le cellule di 9 2 1 Progettazione dei primer oligonucleotidici. mammifero 129 per un esperimento di PCR 158, Clonaggio di geni senza l utilizzo di vettori 130 9 2 2 Determinazione della temperatura corretta. Bibliografia 131 da utilizzare 160,9 3 Dopo la PCR la caratterizzazione dei.
Capitolo 8 prodotti di amplificazione 162, 9 3 1 L elettroforesi su gel dei prodotti di PCR 162. L isolamento del clone di un singolo,9 3 2 Il clonaggio dei prodotti di PCR 164. 9 3 3 Il problema della frequenza di errore della, 8 1 Il problema della selezione 133 polimerasi Taq 165. 8 1 1 Le due tecniche fondamentali per ottenere 9 4 La real time PCR consente di. il clone di interesse 133 quantificare il materiale di partenza 167. 8 2 La selezione diretta 135 9 4 1 Esecuzione di un esperimento di PCR. 8 2 1 Il recupero della capacit di sopravvivenza quantitativa 167. indotto dal marcatore aumenta le 9 4 2 La real time PCR consente di quantificare. applicazioni della selezione diretta 135 anche l RNA 168. 8 2 2 Scopi e limiti della tecnica del recupero Bibliografia 170. della sopravvivenza 137,8 3 L identificazione di un clone all interno. di una genoteca 138,8 3 1 Librerie di geni 138, Non tutti i geni vengono espressi Il clonaggio dei geni e l analisi del.
contemporaneamente 139,Gli mRNA possono essere clonati sotto forma di. DNA nella ricerca scientifica 171,DNA complementare 139. 8 4 Metodi di identificazione di un clone 141,8 4 1 I filamenti complementari di acido nucleico. Capitolo 10, vanno incontro a ibridazione reciproca 141 Il sequenziamento dei geni e dei. 8 4 2 Analisi con sonda di ibridazione su colonie genomi 173. o placche 142,Marcatura con tracciante radioattivo 143.
10 1 Il sequenziamento tramite, Marcatura non radioattiva 144 terminazione della catena di DNA 174. 8 4 3 Esempi pratici di utilizzo delle sonde di 10 1 1 Una visione d insieme del sequenziamento a. ibridazione 144 terminazione di catena 174, Sonde a elevata frequenza di ibridazione per 10 1 2 Non tutte le DNA polimerasi possono essere. analizzare una libreria di cDNA 145 utilizzate per il sequenziamento 176. Sonde oligonucleotidiche per geni i cui prodotti 10 1 3 Sequenziamento a terminazione di catena. proteici sono stati caratterizzati 146 con la DNA polimerasi Taq 177. 10 1 4 Limiti del sequenziamento a terminazione 11 3 2 Analisi delle proteine per mutagenesi in vitro 216. di catena 179 Esistono tipi diversi di mutagenesi in vitro 217. 10 2 Le tecniche di sequenziamento di Introdurre una mutazione puntiforme in un gene. clonato usando un oligonucleotide 217,seconda generazione 180. Altri metodi per generare una mutazione, 10 2 1 Preparazione di una libreria per il puntiforme in un gene clonato 219. sequenziamento di seconda generazione 181 Potenziali applicazioni della mutagenesi in vitro 221. Frammentazione del DNA 181, Immobilizzazione della libreria 182 Bibliografia 222.
Amplificazione della libreria 183, 10 2 2 Metodi di sequenziamento di seconda Capitolo 12. generazione 183 Lo studio dei genomi 223,Il sequenziamento per reversione della. terminazione 184 12 1 L annotazione dei genomi 223. Il pirosequenziamento 185 12 1 1 L identificazione dei geni all interno di una. 10 2 3 Il sequenziamento di terza generazione 186 sequenza genomica 224. 10 2 4 Sequenziamento di geni specifici con le La ricerca delle fasi di lettura aperte 224. tecniche di seconda generazione 187 Le scansioni delle ORF sono poco efficaci nel. localizzare i geni all interno dei genomi eucariotici 225. 10 3 Come si sequenzia un genoma 187, La localizzazione dei geni facilitata dalla ricerca. 10 3 1 L approccio shotgun per il sequenziamento di omologia 226. dei genomi procariotici 189 Comparazione tra sequenze di genomi correlati 227. Sequenziamento shotgun del genoma di Identificazione dei siti di legame per proteine. Biotecnologie molecolari registra gli indispensabili aggiornamenti ma rimane un testo introduttivo che spiega come si eseguono il clonaggio dei geni la PCR e altre tecniche di analisi del DNA e ne illustra le applicazioni nella biologia moderna senza richiedere ai lettori alcuna conoscenza a priori in materia

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