TECNICHE DI FINGERPRINTING E ANALISI MOLECOLARE

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PCR Polymerase Chain Reaction LA TECNICA DI BASE, Il thermal cycler applica alla miscela di reazione. una serie CICLI composti da 3 fasi,DENATURAZIONE 95 C. APPAIAMENTO 40 70 C Pcr film exe,ALLUNGAMENTO 72 C. LE COPIE DEL GENE AUMENTANO OGNI CICLO IN,PROGRESSIONE GEOMETRICA ESPONENZIALE. possibile amplificare qualunque tratto del DNA di un batterio. basta conoscere le sequenze a monte ed a valle della zona di. interesse per poter sintetizzare i primer di innesco per la DNA. polimerasi,COSA AMPLIFICARE,16S tRNA tRNA 23S,Si possono amplificare.
REGIONI SPAZIATRICI TRA GENI,PARTI DI GENOMI,Sensibilit tassonomica. Geni molto conservati Zone geniche ipervariabili Regioni spaziatrici Zone random nel genoma. Genere Specie Sottospecie Ceppo,Molti geni es 16S rRNA sono un misto di zone. ipervariabili e zone conservate per cui studiando, zone diverse dello stesso gene si possono ottenere. informazioni a diverso livello tassonomico,vedi per esempio la tabella a lato. Vedremo pi avanti le caratteristiche di questi geni. CHI AMPLIFICARE BATTERI COLTIVABILI E NON COLTIVABILI. Storicamente un analisi ambientale prevedeva, 1 Piastramento del campione ambientale su un terreno di coltura.
2 Isolamento dei ceppi in colture pure, 3 Analisi del ceppo microscopio PCR sul suo genoma fenotipo etc. Sfortunatamente non tutti i microrganismi possono essere isolati in laboratorio. Si calcola che meno dell 1 delle specie batteriche ambientali isolabile. Cio su 100 specie diverse in un ambiente io ne posso isolare solo 1. CHI AMPLIFICARE BATTERI COLTIVABILI E NON COLTIVABILI. 1 Non tutti i microrganismi possono essere isolati in laboratorio. 2 Questo significa che gli studi che si basano sulla sola analisi della microflora coltivabile es. analizzando solo le conte batteriche su pochi terreni di coltura sono ben poco veritieri. 3 La non coltivabilit dovuta principalmente ai seguenti fattori. Assenza di un terreno di coltura appropriato, Necessit per quella specie di crescere in co cultura con altri che gli forniscono metaboliti. essenziali alla sua crescita, Fenomeni di quorum sensing cio meccanismi fisiologici che impediscono ad una colonia di batteri. della stessa specie di proliferare ulteriormente quando si raggiunto una determinata densit di. QUALSIASI ANALISI DELLA COMUNITA BATTERICA O FUNGINA. PRESENTE IN UN AMBIENTE NON PUO EVITARE LO STUDIO DELLA. MICROFLORA NON COLTIVABILE, CHI AMPLIFICARE BATTERI COLTIVABILI E NON COLTIVABILI. CAMPIONE ISOLAMENTO BATTERIO IN ESTRAZIONE AMPLIFICAZIONE DI. AMBIENTALE SU PIASTRA COLTURA PURA DEL DNA UN GENE CON PCR. Ceppo puro Prodotto PCR puro, CAMPIONE ESTRAZIONE AMPLIFICAZIONE COME SEPARARE LA MISCELA.
AMBIENTALE DEL DNA DEL GENE CON PCR DEI PRODOTTI PCR. Miscela di ceppi Miscela di prodotti PCR, CHI AMPLIFICARE BATTERI COLTIVABILI E NON COLTIVABILI. Dal punto di vista prettamente tecnico la differenza tra analisi di ceppi puri e di comunit. 1 COLTIVABILI Separazione con piastramenti POI PCR ed analisi. 2 INCOLTIVABILI PCR POI Separazione con clonaggio o su gel POI analisi. Miscela di prodotti PCR,separati su gel Ogni,banda rappresenta una. specie batterica,Popolazione di attinobatteri da pietra silicea in. deserto Sahara separata su terreno di coltura,COME SEPARARE I FRAMMENTI AMPLIFICATI. Matrici di separazione in elettroforesi, AGAROSIO supporto orizzontale plastica 0 5 1 5 cm di spessore.
ACRILAMMIDE supporto verticale vetro 0 5 1 0 mm di spessore. MDE una particolare acrilammide che viene usata per separare i frammenti di DNA. a singola elica come per esempio le formazioni di eteroduplex single strand supporto. verticale vetro 0 5 1 0 mm di spessore, POLIMERI IN CAPILLARI come vedremo si tratta di sistemi estremamente. efficienti nella separazione 0 5 bp capillare vetro 0 05 mm di spessore. Acrilammide Capillare,SEPARAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA MEDIANTE. CLONAGGIO E TRASFORMAZIONE IN E coli, Un altro metodo prevede il clonaggio dei prodotti PCR presenti in una miscela complessa. E possibile legare ogni singolo frammento di DNA amplificato in un DNA circolare plasmide detto vettore. Il vettore pu quindi essere inserito in una cellula batterica recipiente in genere di Escherichia coli Si parla di. trasformazione e E coli si trova in stato competente cio capace di assumere DNA dall ambiente. Il plasmide vettore parte blu nella figura contiene anche altri geni come per esempio un gene che conferisce. resistenza ad un antibiotico geni marker di selezione. Piastrando su terreno con antibiotico i vari E coli solo le cellule che avranno inserito il plasmide potranno. crescere trasformanti, Dopo una notte ogni colonia generata da ogni singola cellula di E coli conterr un solo frammento di prodotto. PCR si pu pertanto isolare la colonia estrarre il plasmide e analizzare il frammento inserito. E per necessario analizzare numerosi cloni e quindi un metodo costoso. SEPARAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA MEDIANTE,CLONAGGIO E TRASFORMAZIONE IN E coli.
Esempio di risultato di un clonaggio ogni cellula contiene un frammento di DNA amplificato. METODI AUTOMATIZZATI DI SEPARAZIONE, Il sequenziatore in realt una normale elettroforesi in grado di separare individuare e. riconoscere qualsiasi frammento genomico purch fluorescente. 1 Frammenti prodotti da una reazione di sequenza e differenti tra loro di un solo. nucleotide, 2 Qualsiasi prodotto di amplificazione o di digestione fluorescente esempio un prodotto. di PCR ottenuto usando almeno un primer marcato con un fluorescente. Fingerprinting di ceppi o comunit,Detection di un gene. ELETTROFORESI CAPILLARE,CCD camera,ABI Prism 310,ELETTROFORESI CAPILLARE SOFTWARE GENESCAN. N picco T di uscita Paia di basi Altezza picco Area picco Datapoint. COSA ESPLORARE ALL INTERNO DEI FRAMMENTI GENOMICI AMPLIFICATI. A Semplicemente si possono osservare l assenza presenza e eventualmente abbondanza di. un frammento genomico FINGERPRINTING, B Altrimenti si pu studiare la sequenza di un gene SEQUENZIAMENTO.
Da un analisi fingerprinting si possono ottenere informazioni sui. Polimorfismi di lunghezza es con corsa su gel e confronto con frammenti a lunghezza nota. Polimorfismi puntiformi di sequenza es tramite digestione enzimatica. Polimorfismi di sequenza es tramite denaturazione del DNA per via chimica. Da un sequenziamento si possono ottenere informazioni filogenetiche e molecolari. PS un analisi fingerprinting pu essere associata ad una di sequenziamento. Taglio della banda,Analisi della sequenza,con un bisturi. IL 16S rRNA,Gene lungo ca 1500 1600 nt dopo la,trascrizione non tradotto in proteina ma. assume una particolare struttura secondaria,che serve per la costruzione del ribosoma. In particolare codifica per la subunit,piccola del ribosoma 16S nei procarioti. negli eucarioti come i funghi il 18S rRNA,Deve assumere una determinata struttura.
tridimensionale per assolvere la sua,funzione quindi ha un basso tasso di. mutazione la maggior parte delle mutazioni,producono ribosomi non funzionanti e non. vengono trasmesse alla progenie,E presente nei genomi in multicopia anche. 15 copie proprio perch essenziale per,la vita Per questo motivo facilmente. TECNICHE DI ANALISI MOLECOLARE a A carico del 16S rRNA b A carico degli ITS dell operone ribosomale c A carico di un qualsiasi altro gene o regione genomica nota d A carico dell intero genoma e Tecniche che non prevedono l uso della PCR Specie Permette di distinguere diverse specie Sottospecie Permette di distinguere diverse

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