Tecniche di biologia molecolare unibo it

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Caratteristiche di una metodica,Sensibilit capacit di non dare falsi negativi. Specificit capacit di non dare falsi positivi,Sicurezza non devono se possibile essere usati. composti dannosi o tossici La tossicit pu,essere fisica chimica o biolgica. Velocit in termini di lavoro uomo ora,Estrazione,acidi nucleici. per estrazione si intende isolamento separazione,di DNA o RNA da un tessuto o da cellule.
Si possono estrarre acidi nucleici totali o isolati. E possibile isolare gli Acidi Nucleici a partire da vari materiali di. Organo intero tessuto colture cellulari sangue ecc. Tipo di acido nucleico,ss DNA ds DNA RNA totale mRNA rRNA tRNA. Risultato desiderato,quantit purezza tempo richiesto. Applicazione,Digestione con ER enzimi di restrizione. Clonaggio o amplificazione,Ibridazione,FASI estrazione. Lisi cellulare caratteristiche, abbastanza AGGRESSIVA da frammentare il materiale di.
abbastanza DELICATA da mantenere l integrit dell acido. Si realizza in base a,distruzione meccanica,distruzione chimica. distruzione enzimatica,Lisi cellulare reagenti usati. sonicatore o omogenizzatore a pestello,congelamento scongelamento shock osmotico. detergenti es SDS o sodio dodecil solfato Tween 20. agenti caotropici NaI ioduro di sodio o GuSCN guanidio. tiocianato o NaSCN sodio tiocianato,enzimi proteinasi K. Omogenizzatore Sonicatore,azione meccanica genera onde acustiche.
ad elevata frequenza, L omogenato cellulare viene CENTRIFUGATO per separare. il pellet che comprende membrane e frammenti cellulari voi. filtrazione, Poi si pu procedere a selezionare gli acidi nucleici in 2. 1 Selezione negativa,si toglie tutto ci che NON DNA. 2 Selezione positiva,si estrae direttamente DNA,Pi potente ma d meno resa. DEPROTEINIZZAZIONE, il metodo tradizionale 1 prevede due passaggi in solventi.
apolari che denaturano le proteine ed allontanano anche i lipidi. fenolo cloroformio alcool isoamilico,cloroformio alcool isoamilico. pH neutro o alcalino del fenolo per DNA,pH acido per l RNA. PRECIPITAZIONE in ETANOLO, gli acidi nucleici precipitano in presenza di etanolo solvente. moderatamente apolare CH3 CH2 tale da far precipitare il. DNA che completamente solubile in acqua L alcool etilico. determina modificazioni strutturali degli Acidi Nucleici che ne. inducono l aggregazione e quindi la precipitazione. Per facilitare la precipitazione si possono aggiungere CATIONI. monovalenti Essa si esegue a 80 C,Lavaggio del pellet. Dopo centrifugazione i pellet di DNA vanno lavati in etanolo 70. e ricentrifugati Tale lavaggio allontana i sali insolubili in tale. Risospensione del DNA, Il DNA viene risospeso in un tampone a bassa forza ionica in.
genere TE Tris EDTA a pH 7 6 8 0, L acido nucleico pu quindi essere dosato ed essere utilizzato per. ulteriori procedure quali digestione con endonucleasi di restrizione. marcatura PCR ecc, In alternativa ai classici metodi di purificazione degli acidi nucleici. esistono in commercio numerosi kit di isolamento e purificazione. diretta e dunque secondo una selezione positiva degli Acidi Nucleici. che rappresentano una alternativa sempre pi utilizzata. Essi garantiscono facilit d uso riproducibilit ed elevato livello di. purificazione,Si basano essenzialmente sull utilizzo di. Kit per estrazione in soluzione es TRI Reagent Sigma. Resine a scambio ionico scambiatori anionici come la DEAE cellulosa. Matrici silicee,Gel filtration,Ultrafiltrazione,Attenzione. NUCLEASI si trovano anche sulla pelle,DNAsi enzimi che degradano il DNA.
richiedono ioni metallici per la loro attivazione,sono termolabili. facilmente inattivate da agenti chelanti o sterilizzaz in autoclave. RNAasi enzimi che degradano l RNA,non richiedono cofattori. possono adsorbirsi a vetro e plastica e rimanere attive. resistono anche alla autoclave,Principi e tecniche base di biologia molecolare. Estrazione acidi nucleici DNA o RNA,Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio. Amplificazione tramite PCR da DNA o RT PCR da mRNA. Verifica dei prodotti di amplificazione tramite elettroforesi su. gel di agarosio,Sequenziamento degli amplificati,Elettroforesi.
acidi nucleici,ELETTORFORESI, metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilit elettroforetica. di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico. si realizza attraverso l utilizzo di un sistema elettroforetico. matrice di gel,cella elettroforetica, alimentatore in cui applicare voltaggio o intensit di corrente costante. tamponi salini,si possono studiare sia gli,acidi nucleici DNA e RNA sia le proteine. Tecniche di biologia molecolare Obiettivi dello studio conoscere i principi base delle tecnologie e le possibili applicazioni Cdl Tecnici di Lab Biomedico Aa 2011 12 Prof ssa Flavia Frabetti Sensibilit capacit di non dare falsi negativi Specificit capacit di non dare falsi positivi Sicurezza non devono se possibile essere usati composti dannosi o tossici La tossicit pu

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