BIOTECNOLOGIE CELLULARI E MOLECOLARI

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INTRODUZIONE 4, CAPITOLO 1 RUOLO DI ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED ATM NELLA PREDISPOSIZIONE AL. 1 1 PREDISPOSIZIONE GENETICA DELLE NEOPLASIE 8,1 2 FUNZIONI BIOLOGICHE DI ATM 9. 1 2 1 Introduzione 9, 1 2 2 L intervento dell ATM nell individuazione e riparazione del danno cellulare 9. 1 3 ATM E CANCRO 14, 1 3 1 La sindrome ataxia telangiectasia nell uomo 14. 1 3 2 Mutazioni sul gene ATM nei pazienti A T e i gruppi di complementazione 15. 1 3 3 ATM e predisposizione al cancro 16,1 3 4 ATM e cancro al seno 16.
1 3 5 Tipi e localizzazione delle mutazioni nei portatori eterozigoti 17. 1 3 6 Splicing mutation nel gene ATM 19, 1 3 7 Correlazioni tra ATM e neoplasie linfoidi 20. 1 4 IL CANE COME MODELLO DI PREDISPOSIZIONE AL CANCRO 25. 1 5 STRUTTURA ED OBIETTIVI DELLO STUDIO 27, 1 6 STUDIO DEL TRASCRITTO E DELLE SEQUENZE CODIFICANTI DI ATM 28. 1 7 1 Materiali Metodi 35,1 8 CONCLUSIONI 49,1 9 BIBLIOGRAFIA 49. CAPITOLO 2 IMPORTANZA DEI RIARRAGIAMENTI GENICI Ig TCR NELLA DIAGNOSI E PROGNOSI. DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE NEL CANE 54,2 1 GENETICA DELLE IMMUNOGLOBULINE 54. 2 1 1 Introduzione 54,2 1 2 Struttura molecolare delle Ig e del TCR 54.
2 1 2 1 Immunoglobuline Ig 54,2 1 2 2 TCR 56, 2 1 3 Organizzazione dei geni delle Ig e del TCR 58. 2 1 3 1 Immunoglobuline 59,2 1 3 2 TCR 60,2 1 4 La diversit immunitaria 61. 2 1 4 1 Ricombinazione somatica Riarrangiamento V D J 61. 2 1 4 2 Diversit combinatoria 64,2 1 4 3 Diversit giunzionale 65. 2 1 4 3 Diversit somatica Maturazione dell affinit 69. 2 2 DIAGNOSI E PROGNOSI MOLECOLARI DELLE MALATTIE LINFOPROLIFERATIVE 71. 2 2 1 Introduzione 71, 2 2 2 Utilizzo delle tecniche molecolari nella diagnosi delle neoplasie linfoproliferative 71. 2 2 3 Ricerca della clonalit 72,2 2 4 Traslocazioni cromosomiche 73.
2 2 5 Malattia Residua Minima MRM 76, 2 3 LA PCR NELLA DIAGNOSI E NEL MONITORAGGIO DELLE NEOPLASIE LINFOPROLIFERATIVE 77. 2 3 1 Introduzione 77, 2 3 2 Amplificazione dei riarrangiamenti genetici dei recettori antigene specifici tramite PCR 79. 2 3 3 Limiti della PCR nella valutazione della clonalit e della MRM 83. 2 3 4 I riarrangiamenti genici clonali dei recettori antigene specifici nelle neoplasie linfoproliferative. 2 3 5 Identificazione dei primer consenso per la ricerca della clonalit nelle neoplasie linfoidi B. 2 3 6 Identificazione dei primer per l amplificazione genica del TCR 86. 2 3 7 Sensibilit della PCR nella valutazione della clonalit dei riarrangiamenti genici dei recettori. antigene specifici nelle neoplasie linfoproliferative canine 87. 2 3 8 Specificit della PCR nella valutazione della clonalit dei riarrangiamenti genici dei recettori. antigene specifici nelle malattie linfoproliferative canine 90. 2 3 9 Determinazione della linea di origine delle neoplasie linfoidi mediante scoperta dei. riarrangiamenti genici dei recettori antigene specifici 91. 2 4 STRUTTURA ED OBIETTIVI DEL PROGETTO 93, 2 4 1 Diagnosi delle malattie linfoproliferative nella specie canina 93. 2 4 2 Prognosi mediante valutazione della malattia residua minima delle malattie linfoproliferative. della specie canina 104,NOTA SUL DIRITTO D AUTORE 133. INTRODUZIONE, Negli ultimi anni la medicina traslazionale che si avvale dell oncologia comparata ha fornito un.
impulso notevole alla ricerca biomedica sul cancro La ricerca integrata utilizza modelli spontanei di. neoplasie negli animali domestici ed in particolare negli animali da compagnia come strumento. efficace per acquisire nuove informazioni sulla biologia delle neoplasie per verificare nuove scoperte. derivanti dall oncologia sperimentale in modelli in vivo e per trasferire rapidamente opzioni. terapeutiche innovative dallo studio pre clinico alla sperimentazione clinica sull uomo. I motivi di tale rinnovato interesse per l oncologia comparata sono molteplici Da un punto di vista. epidemiologico l incidenza del cancro negli animali domestici incrementata nelle ultime decadi. parallelamente all incremento osservato nella specie umana Tale incremento almeno in parte. correlato all incremento dell attesa di vita degli animali da compagnia conseguente al miglioramento. dell alimentazione nonch all ampia diffusione e alle innovazioni delle cure veterinarie. Contestualmente gli animali da compagnia condividono i medesimi ambienti dell uomo e come i loro. padroni sono esposti agli stessi contaminanti ambientali. In molti casi le caratteristiche istologiche delle neoplasie nei pet sono sovrapponibili alle rispettive. neoplasie umane Questo vero ad esempio per i melanomi i linfomi non Hodgkin le leucemie gli. osteosarcomi i sarcomi dei tessuti molli i carcinomi della prostata i carcinomi mammari e della. vescica Anche a livello molecolare sebbene gli studi di oncologia comparata in questo settore siano. ancora limitati microarray tissutali evidenziano i medesimi pattern di espressione di neoplasie quali. gli osteosarcomi Come le neoplasie umane e differentemente dai modelli sperimentali nei roditori da. laboratorio la biologia delle neoplasie negli animali da compagnia presenta le medesime complessit. il microambiente tumorale estremamente complesso ed eterogeneo le cellule neoplastiche. interagiscono con un sistema immunitario competente ed acquisiscono rapidamente farmaco. resistenza cos come le mutazioni somatiche che guidano l evoluzione neoplastica verso fenotipi pi. aggressivi e ad elevata capacit di meta statizzazione sono le medesime. Le informazioni molecolari sulla cancerogenesi negli animali da compagnia sono state rese possibili. dal completamento del sequenziamento del genoma canino e dal notevole e rapido incremento delle. coperture dei genomi degli altri animali domestici La variabilit genetica inter razziale nel cane di. gran lunga maggiore di quella riscontrata nei ceppi di roditori da laboratorio e paragonabile a quella. osservata in popolazioni complesse nella specie umana Di contro la maggiore omogeneit genetica. all interno delle razze si presta allo studio dell interazione tra geni e ambiente. I vantaggi dei modelli spontanei di neoplasie dell uomo includono anche molti aspetti concernenti la. terapia Solitamente i proprietari degli animali sono fortemente motivati a trattare i propri animali con. approcci sperimentali che meglio rispondono all esigenza di garantire il benessere oltre che di curare. la neoplasia Anche gli aspetti normativi che riguardano la sperimentazione di nuove molecole sono. molto meno stringenti di quanto non accada per le sperimentazioni cliniche umane Contestulamente i. dati acquisiti su sperimentazioni animali entrano nei dossier che le industrie farmaceutiche devono. comunque produrre per richiedere lo status di nuovo farmaco sperimentale IND Ancora sebbene. da un punto di vista anatomico e funzionale gli animali da compagnia siano molto simili all uomo il. comportamento biologico delle neoplasie estremamente accelerato e gli indicatori di efficacia di. farmaci sperimentali possono essere misurati ed acquisiti in tempi molto pi ridotti che non nelle. sperimentazioni umane I pi rilevanti esempi di farmaci innovativi che hanno enormi potenzialit di. essere traslati alla medicina umana dopo essere stiati sperimentati con successo nella cura delle. neoplasie sono rappresentati dal vaccino anti melanoma e i farmaci inibitori tirosina chinasici anti KIT. utilizzati per il trattamento del mastocitoma canino e potenzialmente efficaci per il trattamento dei. sarcomi GIST con mutazioni c kit nell uomo, Riportiamo integralmente quello che pu essere considerato il manifesto della medicina traslazionale. e dell importanza dell oncologia comparata pubblicato recentemente su Nature Medicine Cancer. Naturally occurring cancers in pet dogs and humans share many features including histological. appearance tumour genetics molecular targets biological behaviour and response to conventional. therapies Studying dogs with cancer is likely to provide a valuable perspective that is distinct from that. generated by the study of human or rodent cancers alone The value of this opportunity has been. increasingly recognized in the field of cancer research for the identification of cancer associated genes. the study of environmental risk factors understanding tumour biology and progression and perhaps. most importantly the evaluation and development of novel cancer therapeutics Paoloni e Khanna. Nature reviews Cancer 2008, La presente tesi di Dottorato raccoglie i risultati delle ricerche svolte negli ultimi anni in stretta. collaborazione con il laboratorio di Biologia Cellulare e Molecolare BCM del DIMORFIPA che da anni. si occupa di modelli animali di patologie umane, La tesi si articola in 2 capitoli Nel primo capitolo sono esposte le ricerche condotte per valutare il. ruolo delle mutazioni germinali della proteina Ataxia Telangiectasia Mutated ATM in una razza. canina razza boxer che manifesta una evidente e ben documentata predisposizione all insorgenza. di neoplasie con particolare riguardo al linfoma al mastocitoma e alle neoplasie mammarie. Le mutazioni germinali del locus ATM sono studiate da molto tempo nell uomo Nel corso del tempo si. sono accumulate numerose evidenze scientifiche sul probabile ruolo di tali mutazioni nel predisporre. all insorgenza di alcune neoplasie tra cui la malattie linfoproliferative e le neoplasie mammarie. Recentemente tuttavia alcuni studi non hanno confermato tale associazione Dombernowsky et al. 2008 Mao et al 2008 I motivi di tale incertezza possono essere diversi in primo luogo il cancro. con alcune infrequenti eccezioni una patologia polifattoriale dove il background genetico pu. giocare un ruolo importante ma dove i fattori ambientali hanno un peso prevalente in secondo luogo il. numero estremamente elevato di tipologie differenti di mutazioni e di differenti ricadute funzionali. sulla proteina ATM pu complicare notevolmente l interpretazione dell effetto di ciascuna infine la. variabilit genetica nella specie umana rappresenta un limite importante di tutti gli studi di genetica di. popolazione tant che l interesse di molti genetisti rivolto a popolazioni caratterizzate da ridotta. variabilit genetica conseguente a fattori sociologici o di isolamento geografico cd population. Le moderne razze canine si sono originate ed evolute in tempi che da un punto di vista del genetista. sono considerati molto recenti e che possiamo fare risalire all epoca Vittoriana La pressione selettiva. operata dagli allevatori sulla base di caratteristiche fenotipiche morfologiche funzionali e attitudinali. avvenuta con ampio ricorso agli accoppiamenti tra consanguinei e all utilizzo di pochi riproduttori. fondatori Conseguentemente la variabilit fenotipica e genetica tra le diverse razze estremamente. elevata mentre al contrario all interno di ciascuna razza la variabilit genetica minima tanto che. ciascuna razza pu essere considerta un closed gene pools Ad esempio la variabilit genetica tra le. razze canine rappresenta il 27 della variabilit totale della specie canina contro il 5 10 della. variabilit tra le popolazioni umane Ancora il range medio di linkage disequilibrium pari a 2Mb nel. cane contro circa 0 28 Mb nell uomo Wayne e Ostrander 2007. In considerazione di quanto sopra esposto il cane si configura come un modello efficace ed. estremamente vantaggioso anche da un punto di vista economico per lo studio e la mappatura di. malattie complesse come la predisposizione al cancro. Nel secondo capitolo della presente tesi sono raccolti i risultati degli studi finalizzati alla messa a. punto di tecniche molecolari per la diagnosi delle malattie linfoproliferative e per il monitoraggio della. malattia residua minima nel cane, Anche in questo caso la notevole omologia tra cane e uomo nella struttura dei loci delle. immunoglobuline e del T cell receptor ha consentito di attingere ampiamente dagli studi condotti nella. specie umana con l obiettivo di definire strategie e tecniche che avessero una ricaduta pratica nella. gestione clinica dei cani affetti da linfomi Tuttavia poich il linfoma del cane rappresenta un ottimo. modello di studio del linfoma non Hodgkin dell uomo la possibilit di utilizzare strumenti molecolari. per la valutazione dell efficacia dei trattamenti terapeutici rende il modello ancora pi attraente per la. sperimentazione di nuove molecole Infine e come esito non previsto tra i nostri obiettivi le strategie. messe a punto per il cane proprio in considerazione della sostanziale omologia con la specie umana si. sono rivelate potenzialmente in grado di applicazione anche alla medicina umana in termini di analoga. accuratezza ma con minor costo rispetto alle tecniche attualmente utilizzate. CAPITOLO 1 RUOLO DI ATAXIA TELANGIECTASIA MUTATED ATM NELLA. PREDISPOSIZIONE AL CANCRO,1 1 PREDISPOSIZIONE GENETICA DELLE NEOPLASIE.
Il cancro una patologia eminentemente polifattoriale in cui intervengono numerosi fattori quali. esposizione ambientale a tossici alimentazione esposizione a raggi UV fumo di tabacco virus ed altri. che interagiscono con il background genetico individuale Molte di queste noxe determinano mutazioni. somatiche e o alterazioni epigenetiche che rivestono un ruolo eminente nella cancerogenesi tanto che. si pu affermare che il cancro una malattia genetica che solo talvolta pu essere ereditaria Circa il. 70 delle neoplasie considerato sporadico e legato in modo stocastico all esposizione a fattori di. rischio Nel restante 30 dei casi le neoplasie sono considerate eredo familiari La predisposizione. punto di tecniche molecolari per la diagnosi delle malattie linfoproliferative e per il monitoraggio della malattia residua minima nel cane Anche in questo caso la notevole omologia tra cane e uomo nella struttura dei loci delle immunoglobuline e del T cell receptor ha consentito di attingere ampiamente dagli studi condotti nella

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