Applicazione di metodi molecolari nella diagnosi di alcune

Applicazione Di Metodi Molecolari Nella Diagnosi Di Alcune-PDF Download

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CAPITOLO 1 pag 4, LA PCR REAL TIME NELLA DIAGNOSI DI SEPSI NEL PAZIENTE. ONCOEMATOLOGICO,PREMESSA pag 4,1 SEPSI pag 7,1 1 Definizione pag 7. 1 2 Patogenesi della sepsi pag 7,1 3 Epidemiologia della sepsi pag 11. 1 4 Quadro clinico della sepsi pag 13,1 5 Diagnosi di sepsi pag 14. 1 5 1 Esami chimico clinici pag 14,1 5 2 Analisi microbiologiche l emocoltura pag 14.
1 5 3 Diagnosi molecolare pag 17,1 6 Cenni di terapia pag 21. 2 OBBIETTIVO DELLO STUDIO pag 23,3 MATERIALI E METODI pag 25. 3 1 I pazienti pag 25,3 2 Emocolture pag 26,3 3 PCR real time pag 27. 3 3 1 LightCycler SeptiFast Test MGRADE pag 31,3 4 Analisi statistica pag 35. 4 RISULTATI pag 36,5 DISCUSSIONE pag 42,6 BIBLIOGRAFIA pag 45.
CAPITOLO 2 pag 52, ANALISI COMPARATIVA DEL GENE PLASMIDICO ORF3 DI Chlamydia. trachomatis e Chlamydia pittaci MEDIANTE RFLP PCR,1 INTRODUZIONE pag 52. 1 2 Classificazione e definizione pag 52,1 3 Ciclo di sviluppo pag 54. 1 4 La cellula batterica pag 55,1 5 Genoma pag 57,1 6 Struttura antigenica pag 59. 1 7 Infezioni pag 60,1 8 Diagnosi di laboratorio pag 61.
1 9 Cenni di terapia pag 63,2 OBBIETTIVO DELLO STUDIO pag 64. 3 MATERIALI E METODI pag 65,3 1 Ceppi batterici pag 65. 3 2 Colture cellulari pag 65,3 3 Estrazione del DNA pag 67. 3 4 PCR del gene orf3 e analisi del polimorfismo dei siti di restrizione RFLP pag 67. 3 5 Clonaggio di ORF3 e determinazione della sequenza nucleotidica pag 68. 3 6 Espressione e purificazione della proteina pgp3 ricombinante di C pag 69. 3 7 SDS PAGE e Western Immunoblotting pag 76,4 RISULTATI pag 77. 4 1 RFLP PCR based del gene orf3 pag 77,4 2 Analisi della sequenza del gene orf3 pag 77.
4 3 Analisi WB pag 77,5 DISCUSSIONE pag 79,6 BIBLIOGRAFIA pag 85. CAPITOLO 1, LA PCR REAL TIME NELLA DIAGNOSI DI SEPSI NEL PAZIENTE. ONCOEMATOLOGICO, La diagnostica di laboratorio ha subito a partire dagli anni novanta importanti cambiamenti. sia di tipo tecnologico che organizzativo in seguito all avvento delle tecniche di Biologia. Molecolare 1 Il successo nel trattamento di un paziente con un infezione batterica richiede. una rapida e specifica identificazione dell agente eziologico L identificazione dei batteri. patogeni mediante i metodi tradizionali basati sull espressione fenotipica di antigeni o sui. prodotti biochimici del metabolismo ancora un elemento cruciale nel processo diagnostico I. metodi di coltura e sottocolture dei batteri specialmente nel caso di batteri esigenti lunghi. tempi di replicazione esigenze nutrizionali complesse mancanza di terreni idonei alla crescita. in vitro e dopo inizio di una terapia antibiotica possono tuttavia dimostrarsi fallimentari e. prolungare la diagnosi definitiva e il trattamento del paziente Contemporaneamente al. miglioramento delle tecniche tradizionali come l introduzione dell automazione delle. emocolture il laboratorio di microbiologia clinica ha progressivamente introdotto i test basati. sugli acidi nucleici NATs nucleic acid based tests per l identificazione dei patogeni in. modo rapido ed affidabile tabella 1 In virologia le tecniche molecolari hanno aperto una via. diretta alla diagnosi e hanno consentito il monitoraggio dell attivit replicativa virale durante. la storia naturale dell infezione e in seguito a terapia oltre ad essere utilizzate nei test di. farmacoresistenza e genotipizzazione Non mancano applicazioni nella diagnostica. parassitologica e nel campo della micologia relativamente alle sempre pi diffuse infezioni da. lieviti e funghi filamentosi nei pazienti neutropenici La Polymerase Chain Reaction. PCR a partire dalla sua introduzione nei laboratori nel 1986 la tecnica di amplificazione. degli acidi nucleici pi largamente usata nel laboratorio microbiologico e ormai ha sorpassato. l applicazione dei metodi basati sul principio dell ibridazione e quelli basati sul principio. dell amplificazione del segnale Dopo il primo test NAT approvato nel 1988 dalla Food and. Drug Administration per la Chlamydia trachomatis e la Neisseria gonorhoeae oggi si stanno. sviluppando metodiche NATs capaci di rilevare virtualmente ogni batterio patogeno Il. vantaggio dei metodi NATs rispetto ai metodi microbiologici include la possibilit di avere. risultati in tempi rapidi specifici e con un elevatissima sensibilit Nell ambiente ospedaliero. il fattore tempo estremamente importante per la somministrazione tempestiva di un. trattamento adeguato oltre a consentire potenzialmente una riduzione dei tempi di degenza. Le epidemie in comunit e le infezioni nosocomiali potrebbero essere meglio controllate se. una rapida identificazione del agente patogeno consentisse un immediato isolamento del. paziente e la profilassi dei contatti Inoltre i programmi di controllo delle infezioni. ospedaliere e quelli epidemiologici hanno tratto largo beneficio dall uso dei NATs per la. tipizzazione dei batteri e l individuazione dei geni di resistenza agli antibiotici tabella 2 7 8. Tabella 1 Esempi di applicazione dei metodi molecolari nella diagnosi di malattie infettive. Settore Esempi, Virologia Virus Herpes Simplex Varicella Zoster Herpes Virus Umano. tipo 6 7 8 Citomegalovirus Virus di Epstein Barr, Virus Respiratori Influenza Virus Respiratorio Sinciziale.
Parainfluenza Virus Adenovirus,SARS CoV Virus dell Influenza Aviaria. HIV HBV HCV,Papillomavirus enterovirus, Batteriologia C trachomatis N gonorrhoeae micoplasmi genitali. B pertussis M tuberculosis MOTT,T whipplei B henselae. M pneumoniae C pneumoniae Legionella spp,N meningitidis S pneumoniae. Parassitologia Plasmodium spp Toxoplasma gondii,Micologia P jiroveci Aspergillus spp Candida spp.
Severe acute respiratory sindrome coronavirus, Le metodiche NATs possono essere impiegate per rilevare la presenza del microrganismo. direttamente nel campione clinico o in coltura abbreviandone i tempi di incubazione oppure. ancora in campioni la cui coltura risultata negativa infatti non necessario che i batteri. mantengano la capacit di moltiplicarsi essendo il materiale genomico di questi il bersaglio. del test Nel caso delle meningiti batteriche la mancanza di una diagnosi precoce e per la. somministrazione di una corretta terapia antibiotica nel paziente e per la chemioprofilassi dei. contatti pu avere conseguenze devastanti I metodi PCR possono fornire un risultato nello. stesso giorno a partire dal campione di liquor cefalo rachidiano In alcuni laboratori gi. possibile procedere routinariamente alla ricerca di Neisseria meningitidis nei casi clinici. sospetti e risalire al genotipo per i sierogruppi B e C PCR multiplex sono state sviluppate per. la rapida individuazione dei batteri comune causa di meningiti insieme con la N. meningitidis lo Streptococcus pneumoniae e l Haemophilus influenzae tipo B da soli sono. responsabili del 90 delle meningiti batteriche 9, L isolamento dei batteri dal sangue ha sempre avuto un ruolo importante nella diagnosi per i. pazienti febbrili per stabilire la presenza di un infezione e perci escludere una causa di. febbre di origine non infettiva per rassicurare il clinico rispetto alla scelta della terapia. empirica e per ottimizzare la terapia antibiotica dopo aver saggiato la sensibilit del batterio. isolato ai farmaci Le emocolture hanno avuto un ruolo centrale nei laboratori microbiologici. come gold standard per rilevare un infezione del torrente circolatorio in pazienti febbrili. Nei decenni trascorsi vari metodi sono stati proposti per ottimizzare la diagnosi di infezione. batterica e o fungina del sangue che in particolare rimane una sfida aperta in pazienti critici. quali sono i pazienti immunocompromessi come i pazienti con neoplasia in cui. approssimativamente la met delle emocolture rimane negativo. Tabella 2 Esempi dell uso dei metodi molecolari nel laboratorio di microbiologia clinica. diversi dall identificazione dei microrganismi,Test Esempi. Monitoraggio del Citomegalovirus Epstein Barr Virus. carico virale HBV HCV HIV,Genotipizzazione HIV HBV HCV Papillomavirus. Genotipizzazione M tuberculosis N meningitidis,Farmacoresistenze MRSA VRE ESBL M tuberculosis.
PCR a largo spettro Endocarditi infettive meningiti batteriche. S aureus meticillino resistenti,Enterococchi vancomicina resistenti. beta lattamasi ad ampio spettro,1 1 Definizione, Per circa un secolo la sepsi stata definita come una risposta infiammatoria sistemica. dell ospite ad un infezione L infiammazione durante la sepsi d origine ad una sindrome. sistemica con numerose manifestazioni come il danno tissutale l aumento della permeabilit. vascolare fino alla disfunzione di molti organi e allo shock Originariamente la sepsi si. riteneva essere associata alla presenza di batteri nel torrente circolatorio batteriemia ed il. termine sepsi e setticemia erano rispettivamente intercambiabili sul piano clinico 10. Nel 1989 Bone et al stabilirono una semplice definizione per la sindrome settica basata su. specifici sintomi clinici che includeva una sorgente di infezione accertata La. sintomatologia clinica tuttavia era presente frequentemente anche in pazienti caratterizzati da. pancretite o da trauma Questa discrepanza fu tenuta in considerazione dalla Consensus. Conference del 1992 quando fu coniato il termine Sindrome da Risposta Infiammatoria. Sistemica SIRS che non richiede la presenza di infezione Inoltre furono introdotti i. termini di sepsi severa e di shock settico per differenziare diversi stadi della malattia. tabella 3 12, Attualmente stato proposto il sistema di stratificazione PIRO che descrive lo stadio della. sepsi sulla base della Predisposizione genetica del tipo e della fonte di Infezione della. Risposta dell ospite e dell insufficienza d Organo Questa classificazione prende in. considerazione lo stato clinico del paziente e le analisi cliniche ed un sistema pi preciso per. classificare i disordini correlati alla sepsi,1 2 Patogenesi della sepsi. La risposta infiammatoria sistemica si basa su un sistema di attivazione cellulare con rilascio. di mediatori pro ed antinfiammatori che contribuiscono alla insorgenza di quadri clinici a. gravit crescente SIRS Sepsi Sepsi grave Disfunzione d organo Shock settico L evento. chiave la rapida attivazione della cascata dei sistemi umorali complemento coagulazione. sistema callicreina chinine e delle cellule che sostengono la risposta infiammatoria. granulociti monociti linfociti macrofagi cellule endoteliali Queste cellule una volta. attivate producono e rilasciano i mediatori della risposta infiammatoria e molecole vasoattive. o citotossiche Questo processo caratterizzato da interazioni sinergiche e antagonistiche a. volte ridondanti e una netta differenziazione tra mediatori ed effettori impossibile a causa. delle numerose funzioni pleiotropiche di queste sostanze Al centro del processo si pone la. reazione immunologia alle tossine microbiche,Tabella 3 Definizione clinica di sepsi.
Temperatura 38 3 C o 36 C,SIRS sindrome da,Velocit del cuore 90 battiti minuto. Velocit respiratoria 20 respiri minuto o PaCO2 32 mmHg. infiammatoria, Numero di cellule bianche nel sangue 12 109 l o 10 delle. forme immature, Risposta sistemica all infezione che si manifestata mediante due o. Sepsi pi condizioni caratteristiche della SIRS SIRS infezione. Sepsi associata a disfunzione d organo ipoperfusione o ipotensione. Sepsi severa compresa acidosi lattica oliguria o alterazioni acute dello stato. Ipotensione indotta da sepsi es pressione sistolica 90 mmHg. Shock settico nonostante l utilizzo di infusioni di liquido Pu comprendere. acidosi lattica oliguria alterazioni acute dello stato mentale. MODS sindrome, Presenza di disfunzione d organo in un paziente acuto in cui. della disfunzione, l omeostasi non pu essere mantenuta senza interventi.
multi organo, I patogeni classicamente responsabili di sepsi severa sono i batteri Gram negativi e le loro. endotossine lipopolisaccaride LPS Inoltre stato dimostrato che anche il componente. della parete batterica dei Gram positivi peptidoglicani acido teicoico o dei funghi e le. esotossine tossina 1 della sindrome da shock tossico TSST 1 possono attivare la cascata. infiammatoria Queste molecole legano recettori sulla membrana cellulare e recettori. solubili CD14 MBP mannose binding protein TLR toll like receptor inducendo. un eccessiva produzione e rilascio di mediatori pro infiammatori come il TNF alfa tumor. necrosis factor Interleuchina 1 IL 1 Interleuchina 6 IL 6 ed altri tabella 4 Il primo. organo bersaglio nell attivazione di uno stato settico proprio l endotelio vascolare l azione. sulle cellule endoteliali mediata da citochine e dall adesione dei batteri all endotelio stesso. porta all espressione di molecole cui si legano i neutrofili circolanti con lo scopo di fagocitare. i batteri adesi alla parete vascolare 16, Tabella 4 Mediatori prodotti da cellule del sistema immunitario implicati nella patogenesi. della sepsi,Mediatori Effetti tipici, attivano i neutrofili i linfociti e l endotelio vascolare. Citochine stimolano le molecole di adesione cellulare. IL 1 IL 6 IL 12 IL inducono le prostaglandine l ossido nitrico sintasi e le. 15 IL 18 TNF proteine della fase acuta,MIF HMGB1 IL 10 inducono febbre. IL 10 un regolatore negativo di questi effetti,Chemochine.
mobilizzano e attivano le cellule infiammatorie,IL 8 MIP 1 MIP 1. attivano i macrofagi,MCP 1 MCP 3,Mediatori lipidici. In virologia le tecniche molecolari hanno aperto una via diretta alla diagnosi e hanno consentito il monitoraggio dell attivit replicativa virale durante la storia naturale dell infezione e in seguito a terapia oltre ad essere utilizzate nei test di farmacoresistenza e genotipizzazione 2 3 4 Non mancano applicazioni nella diagnostica parassitologica e nel campo della micologia

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